磷酸化蛋白做WB的七小妙招（11.26周四）

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磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。然而，有时会出错，本文在此向各位介绍磷酸化蛋白做WB的一些小妙招。

● 一定要在Lysis Buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。（磷酸酶抑制剂中，钒酸钠（Na3VO4）的使用浓度为1mM，氟化钠（NaF）的使用浓度为1mM）

● 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间，因为磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分；二抗则室温1小时即可。

● 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。

● 抗体的稀释倍数要优化，可以根据厂商建议进行优化。

● 用含5% BSA的TBST稀释抗体，不要用常见的5% -Fat Milk的TBST。

● 磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅.。

● 磷酸化蛋白WB时，用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗5min3次即可，宁愿背景深一些,总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。

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